ELISA试剂盒基本原理： 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被相关指标的抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的相关指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 ELISA试剂盒试剂盒组成： 中文名称 英文名称 规格 保存 ELISA酶标板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 4℃/-20℃ 冻干标准品 Reference Standard 2/1 支 4℃/-20℃ 标准品&样品稀释液 Reference Standard & Sample Diluent 1瓶20mL/12mL 4℃ 浓缩生物素化抗体 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1支120μL/70μL 4℃/-20℃ 生物素化抗体稀释液 Biotinytated Detection Ab Diluent 1瓶 10mL/6mL 4℃ 浓缩HRP酶结合物 Concentrated HRP Conjugate 1支120μL/70μL 4℃(避光) 酶结合物稀释液 HRP Conjugate Diluent 1瓶 10mL/6mL 4℃ 浓缩洗涤液（25×） ConcentratedWashBuffer (25×) 1瓶 30mL/16mL 4℃ 底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1瓶 10mL/6mL 4℃(避光) 反应终止液 S Solution 1瓶 10mL/6mL 4℃ 封板覆膜 Plate Sealer 5/3 张 产品说明书 Product Description 1 份 质检报告 Certificate of Analysis 1 份 特别说明： [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整） 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃. ELISA试剂盒检测准备工作： 1. 请提20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。 2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。 3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为8000pg/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。 4. 生物素化抗体工作液：实验计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。 5. 酶结合物工作液：实验计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。 当日使用。 注意事项： A 仔细阅读说明书。 B 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。 C 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。 D 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。 E 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。 F 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。 G 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书的条件存储。 H 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之，必需不停搅拌。 I 保证充分的孵育时间和温度。 J 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。 K 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。 L 在实验开始之，安排好实验流程。 M 在实验开始之，清洁工作台。 N 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系 结果判断： 1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。 2. 使用业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 会出现的问题及解决办法： 1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。 a.原因：未加入酶标记物。 解决办法：请按照操作步骤进行。 b.原因：试剂盒内容物未能充分回。 解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。 c.原因：室温太低。 解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。 d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。 解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。 e.原因：试剂盒已过有效期限。 解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。 2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。 a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。 解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。 b.原因：操作时间拖太久。 解决办法：请在方法熟练后再进行操作。 c.原因：微孔间相互污染。 解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。 d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。 解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。 e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。 解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。 f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。 解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。 3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。 a.原因：室温太高(>25℃)。 解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。 b.原因：底物溶液受到污染。 解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。 c.原因：反应时间超过太久。 解决办法：请控制反应时间。 d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。 解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留) 4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。 a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。 解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。 b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。 解决办法：请参考2-f. c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。 解决办法： 请参考2-d.
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